正確地認(rèn)識(shí)和使用酶標(biāo)儀

作為微孔板比色計(jì)的酶標(biāo)儀，其基本功能不外乎一個(gè)比色測定，所不同的是在測定波長范圍、吸光度范圍、光學(xué)系統(tǒng)、檢測速度、震板功能、溫度控制、定性和定量測定軟件功能等方面的差異，當(dāng)然全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)還具有自動(dòng)洗板、溫育、加樣等功能。在臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)際工作中，實(shí)驗(yàn)人員在使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定操作時(shí)，有時(shí)難免會(huì)對(duì)酶標(biāo)儀的一些性能指標(biāo)產(chǎn)生迷惑，甚至對(duì)酶標(biāo)儀的應(yīng)用產(chǎn)生錯(cuò)誤的理解。如諸如使用酶標(biāo)儀較用肉眼觀察測定的陽性率明顯增加這樣的問題。
一、測定波長 一般酶標(biāo)儀的測定波長在400～750nm或800nm之間，*可以滿足ELISA的顯色測定。目前國內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過氧化物酶（HRP），底物通常為四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和鄰苯二胺（OPD），其在過氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2，2，—二氨基偶氮苯（DAB）和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5．0左右時(shí)，DAB在450nm波長處有zui大吸收，當(dāng)pH值降為L 0時(shí)，zui大吸收波長移至492 nm，同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有zui大消光系數(shù)，如果HRP量少，H：O：和TMB過量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽離子根。降低pH，即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)榈穆?lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此，450nm和492 nm兩個(gè)波長是目前ELISA測定zui常用的。各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉(zhuǎn)換的部件，可以同時(shí)安裝6～8片濾光片，所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個(gè)波長，有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大。除了這兩個(gè)基本濾光片外，考慮到雙波長比色的需要，還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片，其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇。有時(shí)，有的實(shí)驗(yàn)室希望用酶標(biāo)儀作微量生化測定，故酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家對(duì)其生產(chǎn)的酶標(biāo)儀擴(kuò)展了紫外檢測功能，此時(shí)需要一個(gè)340 nm波長濾光片。此時(shí)，酶標(biāo)儀的測定波長范圍就成為340—750nm或800nm。
酶標(biāo)儀有單波長和雙波長檢測功能有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。所謂的“單波長”就是使用一種對(duì)顯色具zui大吸收的波長即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測定；而“雙波長”則除了用對(duì)顯色具zui大吸收的波長即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測定外，同時(shí)用對(duì)特異顯色不敏感的波長如630 nm進(jìn)行測定，酶標(biāo)儀zui后打印出來的吸光度則為二者之差。630 nm波長下得到的吸光度是非特異的，來自于板孑L上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測定中，使用雙波長，且不必設(shè)空白孔。
二、測定的吸光度范圍 通常，酶標(biāo)儀的吸光度測定范圍在。一2．5之間即可以滿足ELISA的測定要求。早期的酶標(biāo)儀可測定的吸光度一般在。一2．5之間，但現(xiàn)在基本上都做了拓寬，可達(dá)到3．5以上，并且能保持很好的精密度與線性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK—2的吸光度測定范圍為0—3．5，而Multiskan Ascent的吸光度測定范圍（Abs）達(dá)0～4．0，在0～4．0范圍，線性誤差不超過±2．0％，在0．3—3．0吸光度范圍內(nèi)，測定精密度CV小于±0．2％；3．0～4．0Abs范圍內(nèi)，測定精密度CV小于士0．2％。因此，對(duì)于酶標(biāo)儀的吸光度范圍不必去刻意追求大的吸光度范圍，主要要看在一定的吸光度范圍內(nèi)的線性和精密度如何。
三、光學(xué)系統(tǒng) 酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道（通常為8或12通道，亦有單通道）檢測，一般為硅光管或光導(dǎo)纖維，除測定通道外，有的酶標(biāo)儀還有一個(gè)參比通道，每次測定可進(jìn)行自我校準(zhǔn)。酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)功能如何，均可通過酶標(biāo)儀測定的吸光度范圍、線性度、精密度和準(zhǔn)確度等體現(xiàn)出來。光學(xué)系統(tǒng)好的話，則上述指標(biāo)也應(yīng)較佳。測定的精密度與測定通道之間的均一性有直接關(guān)系。單通道可避免因通道不同所致的差異。
四、檢測速度 酶標(biāo)儀的檢測速度是指其完成比色測定所需要的時(shí)間。檢測速度快，有利于提高檢測的精密度，即避免由于測定過程中，因測定時(shí)間不同所致的各微孔間吸光度間的差異。目前市場上常見的酶標(biāo)儀檢測速度都非常快，通常在數(shù)秒鐘內(nèi)，如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2和MK—3檢測96孔只需2s（連續(xù)模式）或5s（步進(jìn)模式）。Multiskan Ascent為單通道檢測，亦只需9s（連續(xù)模式）或14s（步進(jìn)模式）。又如BioRad公司的Benchmark的檢測速度單波長為7s，雙波長為15s。
五、震板功能 酶標(biāo)儀的震板功能是指酶標(biāo)儀在對(duì)ELISA板孔進(jìn)行比色測定前對(duì)其進(jìn)行振蕩混勻，使板孔內(nèi)顏色均一。目前市場上常見的酶標(biāo)儀均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋轉(zhuǎn)等方式及振蕩幅度等任意調(diào)節(jié)，如Labsystems的MK-2；有的則較為固定，如BioRad 550。使用有震板功能的酶標(biāo)儀，在進(jìn)行ELISA測定顯色反應(yīng)完成加入終止劑后，可不必振蕩混勻，直接放人酶標(biāo)儀上測定即可。
六、溫育功能 溫育功能是指酶標(biāo)儀本身能按要求自動(dòng)地控制儀器內(nèi)部的溫度，使得ELISA測定中微孔板條的溫育過程可在儀器內(nèi)部完成，而無需再外配溫箱。目前，只有少部分酶標(biāo)儀具有此種功能，如Labsystems公司的Multiskan Ascent，BioRad公司的Benchmark和Biotek公司的ElxS08等。溫育功能只是酶標(biāo)儀的一個(gè)附加功能，是否具有并不能說明酶標(biāo)儀檔次的高低及儀器的優(yōu)劣。作為實(shí)驗(yàn)室是否選擇，則可根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的條件及需要來決定。
七、軟件功能 軟件功能是指酶標(biāo)儀所具有的對(duì)ELISA定性和定量測定及其他測定方式如酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)、紫外和凝集等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析并報(bào)告結(jié)果的功能。軟件功能是中酶標(biāo)儀的一個(gè)非常重要的功能。如果硬件方面區(qū)別不大，則軟件就成為判定酶標(biāo)儀優(yōu)劣的惟一指標(biāo)。對(duì)于用戶來說，好的軟件功能，對(duì)實(shí)際工作會(huì)有較大的幫助。ELISA定性測定，酶標(biāo)儀如具有陽性判斷值（cut-off）及其測定“灰區(qū)”（即指測定吸光度處于cut—off周圍的一定區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)結(jié)果應(yīng)為“可疑”）的統(tǒng)計(jì)計(jì)算功能，不但方便了實(shí)驗(yàn)室工作人員，而且在某些特定的情況下，有很高的實(shí)用價(jià)值。如血站實(shí)驗(yàn)室為篩檢獻(xiàn)血員血進(jìn)行HBsAg、抗HCV和抗HIV等的ELISA測定時(shí)，常會(huì)遇到測定吸光度處于cut-off附近但又低于cut—off的血，按照試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)，可判為陰性，血為合格血，可用于患者輸血，但直覺告訴我們，這樣的血如輸給患者，導(dǎo)致輸血后相應(yīng)疾病發(fā)生的可能性較大，這是由ELISA現(xiàn)有的測定技術(shù)的不確定性所造成的，也就是ELISA測定的“灰區(qū)”的存在使得ELISA測定試劑盒cut-off的設(shè)定只是相對(duì)的準(zhǔn)確，此時(shí)的假陽性和假陰性出現(xiàn)的可能性較低。因此，在血站篩檢獻(xiàn)血員血時(shí)，如以測定“灰區(qū)”的下限作為判斷獻(xiàn)血員血篩檢不合格標(biāo)準(zhǔn)，就可以避免因“灰區(qū)”所致結(jié)果判斷錯(cuò)誤而引起輸血后疾病發(fā)生的可能性。合適的軟件功能對(duì)于ELISA定量測定同樣很重要。有研究表明，四參數(shù)方程能較好地反映免疫測定的劑量反應(yīng)曲線，zui為適合于定量酶免疫測定的曲線擬合。因此，如目的是定量測定，則在酶標(biāo)儀的軟件功能中，要有這種曲線回歸方程計(jì)算分析功能。其他諸如連點(diǎn)、直線等回歸計(jì)算，則可根據(jù)酶標(biāo)儀的應(yīng)用目的而定，如兼用于微量生化測定，則此類回歸計(jì)算就很有必要。
此外，酶標(biāo)儀兼做酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)、凝集反應(yīng)測定所需的軟件是否應(yīng)具備，當(dāng)然也應(yīng)根據(jù)使用目的而定。由于此類軟件一般都較為昂貴，酶標(biāo)儀常另外單獨(dú)按需配備，如果不是實(shí)驗(yàn)室特殊需要，就不必強(qiáng)求這種軟件功能。
八、語言界面 通常進(jìn)口的中酶標(biāo)儀人機(jī)對(duì)話多采用英文。這對(duì)于某些基層實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)存在語言方面的困難，從而難以zui大限度地發(fā)揮酶標(biāo)儀的作用。為解決這方面的問題，已有一些酶標(biāo)儀采用了中文界面，如Labsystems的MK-3。這樣就大大方便了廣大基層實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的使用。
綜上所述，盡管酶標(biāo)儀的發(fā)展極為快速，種類繁多，功能也不斷加強(qiáng)，但其zui根本的功用是不變的，即比色測定。大凡比色測定，其基本要求就是在一定吸光度范圍內(nèi)要有好的測定準(zhǔn)確性、線性和精密性。同樣的吸光度范圍，測定的準(zhǔn)確性、線性和精密性越好則酶標(biāo)儀亦越佳。
而且，由于用于酶標(biāo)儀比色測定的為多孔（通常為96孔）微孔板條，為保證測定的孔間重復(fù)性，則測定速度也是一個(gè)較重要的性能指標(biāo)。至于其他如震板、溫育及有關(guān)的軟件功能，則可根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)室的需要去比較選擇。
正確地認(rèn)識(shí)和使用酶標(biāo)儀